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请详细说明第一代测序技术-Sanger法。 第一代DNA测序技术主要为(1977年(桑格)Sanger)等提出的双脱氧链终止法,也称为Sanger法。 Sanger法的核心原理是:双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)的2’和3’位置都不含羟基(图1-1.1右),因此ddNTP在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键,从而中断DNA的合成反应;在个DNA合成反应体系中分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP,通过凝胶电泳和放射自显影后可根据电泳条带的位置确定待测分子的DNA序列(图1-1.2)。 Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,并且在每个碱基后面进行荧光标记,产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。 Sanger法测序的具体步骤如下: ①分离待测核酸模板,在4支试管中分别加人适当的引物、模板、DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸(dNTP),再在上面4支试管中分别加人一定浓度的带有放射性同位素标记的ddATP ddCTP、ddGTP和ddTTP ②进行DNA合成反应。加入的引物在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应。当ddNTP掺入时,由于它在3’位置没有羟基,故不能与下一个dNTP结合,从而使链延伸终止。由于ddNTP在不同位置掺入,所以产生一系列不同长度的新的DNA链。 ③用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离支反应管中的反应产物,由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP).则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处,所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA的3’末端都为同一种双脱氧碱基。 ④放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。 (含图)
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