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实验目的 (　　)光合色素的提取及理化性质掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。 (　　)光合色素的分离与吸收光谱掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。 (　　)光合色素含量的测定掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。

实验仪器及试剂 (　　)光合色素的提取及理化性质实验仪器：研钵、玻璃棒、漏斗、滤纸、试管、酒精灯、试管夹、三角瓶。实验试剂及材料：植物叶片、丙酮、碳酸钙、石英砂、30%KOH甲醇溶液、苯、醋酸铜粉末、50%醋酸溶液。 (　　)光合色素的分离与吸收光谱实验仪器：研钵、玻璃棒、漏斗、滤纸、滤纸条、三角瓶、分光光度计、玻璃棒、漏斗。实验试剂及材料：植物叶片、丙酮、碳酸钙、石英砂、层析液。 (　　)光合色素含量的测定实验仪器: 分光光度计、比色皿、离心机、离心管、研钵、玻璃棒、漏斗、滤纸。实验试剂及材料：植物叶片、丙酮、碳酸钙、石英砂。

实验原理、实验流程、装置示意图（1）光合色素的提取及理化性质实验原理：光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。 ⑤叶绿素分子中 Mg2+与卟啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+ 、Zn2+等离子所取代。（2）光合色素的分离与吸收光谱实验原理：光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。不同合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。 ③叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光。（3）光合色素含量的测定实验原理： ①混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍然可以根据Lambert-Beer定律(A=k L C)求出各组分含量。Lambert定律:A=k L;Beer定律A=k C。 ②叶绿素a、 b 在80% 丙酮溶液中的Amax分别为663nm、 645nm。 ③k-一比吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(　　)为1g/L(0.1%)，比色皿的直径(光径，L) 为1cm 时，所测出的吸光度即为比吸收系数。E一一摩尔吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(　　)为1moI/L，比色皿的直径(光径，L)为1cm 时所测出的吸光度即为摩尔吸收系数。

实验方法、步骤及现象 (　　)光合色素的提取及理化性质实验方法及步骤：光合色素的提取:将植物叶片用剪刀剪碎，再放在天平上，准确称取2g，放入研钵中并加入少许CaCo3和石英砂及5 mI丙酮，充分研磨，再加入10 mI丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。观察荧光现象:与光线垂直的方向观察色素颜色。光破坏作用:1ml色素提取液于室内，1ml 于太阳光下，30min 后观察颜色变化。皂化反应:取一支试管，加入色素提取液 2.5ml，再加入30%K0H甲醇溶液1ml 摇匀，再加入苯2.5ml，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水1ml，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。取代反应:取一支试管，加入 3ml色素逐滴加入50% 醋酸直至溶液变为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，洒精灯上加热，与另一半比较颜色的差异。实验现象：

取代反应： ①加入少许醋酸铜粉末，洒精灯上加热，加热后颜色变为深黄色。（含图）（含图） ②与未加热的一半相比，溶液颜色由绿色变为深黄色，由于加热后叶绿素分解，因此溶液不再为绿色。 (　　)光合色素的分离与吸收光谱实验方法及步骤：光合色素的提取:将植物叶片用剪刀剪碎，再放在天平上，准确称取 2g，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 mI 丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。光合色素分离:剪取适当长度和宽度的滤纸条→ 用上行纸层析法分离色素，将滤纸条放在带有钩子的试管中，固定，试管中加入层析液，层析液在滤液下方1㎝，层析20分钟后，观察结果。吸收光谱的测定:光合色素的吸收光谱: 取色素溶液1mL，加入丙酮3 mL，摇匀后在分光光度计上400到700 nm 处每隔10 nm 进行扫描。各色素的吸收光谱:上述层析出的3~4种色素，分别剪下后溶于3 mL丙酮中，按上述方法扫描。实验现象：（含图）（含图）（含图）（含图）（含图）现象分析：我们组做了两次光合色素的分离，得到的结果都是从上到下分别是胡萝卜素，叶绿素a，叶黄素，叶绿素b。由于我们组做出来的光合作用色素分离被污染了，所以没有进行吸收光谱的测定。用另一个组分离出来的色素做的吸收光谱不一样是因为太阳光不是单一波长的光，到达地表的光波含有从300nm的紫外光到2000nm的红外线，其中只有波长在390~760nm之间的光是可见光，叶绿素吸收光的能力极强。叶绿素吸收光谱的最强吸收区有一个在波长为640~660nm的红光部分，另一个在波长为430~450nm的蓝紫光部。白光中，光被叶绿素大量吸收，而绿光则被叶绿素反射和透射，因此叶片的反射和透射光都呈绿色，叶子呈现绿色，叶绿素溶液也呈绿色。叶绿素的荧光呈红色。胡萝卜素和叶黄素的吸收光谱的最大吸收带在蓝紫光部分，不吸收红光等长波的光。 (　　)光合色素含量的测定实验方法及步骤：方法一:快速测定法：由于叶绿素a、 b在652nm处有共同吸收，k=34.5 mg1.cm-2。可直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，最后浓度单位为 mg/dm2。方法二:分光光度计法：色素提取:将上述植物叶片用剪刀剪碎，准确称取叶片0.2g左右加入少许CaCO3和石英砂及80%丙酮3 mL，充分研磨，转入离心管中 (　　)，再用5mL 80%丙酮洗研钵，转入离心管中，平衡，5000 rpm 离心10 min，记录上清液体积，取1 mL稀释到4 mL。测定:以1 cm比色皿分别测定A663、 A645。使A控制在0.1~0.8之间。实验现象： A663nm时测出的值: （含图） A645nm时测出的值：（含图） Ca=12.7*0.263-2.69*0.203=2.80g/L Cb=22.9*0.203-4.68*0.263=3.42g/L Chla=2.80*4/0.2=56(　　) Chlb=18.7(　　) 符合Chla/Chlb=3:1。叶绿素和橙黄色的类胡萝卜素，通常叶绿素和类胡萝卜素的比例约为3:1，chla与chlb也约为3:l，全部叶绿素和几乎所有的类胡萝卜素都包埋在类囊体膜中，与蛋白质以非共价键结合，一条肽链上可以结合若干色素分子，各色素分子间的距离和取向固定，有利于能量传递。由于我们组采用的植物叶片是绿蒿，所以它的形状不规则，再算面积的时候，不好操作，所以用方法一快速测定法不能测出，就没有测定数据。

实验数据处理 (　　)光合色素含量的测定 Ca=12.7*0.263-2.69*0.203=2.80g/L Cb=22.9*0.203-4.68*0.263=3.42g/L Chla=2.80*4/0.2=56(　　) Chlb=18.7(　　)

实验分析与讨论实验思考题： (　　)光合色素的提取及理化性质

为什么在皂化反应中只能用20%KOH甲醇溶液，而不能用20%KOH甲醇溶液，而不能用20%KOH水溶液？答:因为叶绿素是有机物，不溶于水，色素是有机物只能溶于有机溶剂中，所以用甲醇来当溶剂使用。 (　　)光合作用的分离与吸收光谱

试论述高等植物光合色素的种类及生理功能。答：大多数能进行光合作用的细胞还有第二种类型的叶绿素，即叶绿素b或叶绿素c。在高等植物的细胞中含有叶绿素b,而在其它一些类型的细胞中含有叶绿素 c。不同类型的叶绿素对光的吸收也是不同的，如叶绿素a最大的吸收光的波长在420~663nm,叶绿素b的最大吸收波长范围在460~645nm。当叶绿素分子位于叶绿体膜上时，由于叶绿素与膜蛋白的相互作用，会使光吸收的特性稍有改变。 (　　)光合色素含量的测定

一般正常的植物叶片，Chla/ ChIb=3/1，你所测定的结果符合此比例吗?答：Chla=484mg.gb=158mg.g-1FWChl-1FW 符合2. 两种测定方法含量有何不同?为什么? 答：快速测定法用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，局部含量测定。比较准确，但不便于整体测定，取样多次平均值也不能代表整体叶绿素含量; 分光光度计法采用低杂散光,高分辨率的单光束单色器,保证了波长准确度.波长重复性和更高的分辨率,自动调0%T和100%T,自动调波长用多种方法的数据处理功能,高分辨,宽大的样品糟,可容纳100mm,光径吸收池和相应的反射附件,仪器配有标准的RS-232双向通讯接口,可外接打印机,打印相应的实验数据.个性代的外形设计,轻触式按键使操作更为方便.可见分光光度计广泛应用于医药,卫生,化工,学校,生物化学,石油化工,质量控制,环境保护及科研实验室等化学分析。3.怎样把方法一中的叶绿素含量mg/dm2转换为方法二中的mg/g FW? 怎样测定不同形态的植物叶片的叶面积?叶面积的计算：选取单位面积重量是一个常数的打印纸如A4 或 16K。一般A4打印纸为70~105GSM(　　)。用铅笔轻轻地沿着叶缘在A4纸上划线。用剪刀沿着叶缘剪下A4纸。称所剪下的A4 纸的重量W (　　)。教师评分

（含图）本科学生综合性实验报告姓名秦琼学号 2043204000084 学院生命科学学院专业、班级生物科学20B班实验课程名称植物生理学实验教师及职称杨双龙副教授开课学期 2022 至 2023 学年 1 学期云南师范大学教务处编印实验室睿智楼3幢428 实验时间

年4月08日实验名称模块二—光合色素的提取、分离、吸收光谱及含量的测定

皂化反应：（含图）溶液分为三层，从上到下依次为第一层：浅黄绿色，第二层：浅绿色，第三层：深绿色。原因是叶绿素是一种有机物，且是一种酯，在皂化反应后可生成盐，能溶于水，故在下层，而加入苯后，胡萝卜素在上层。

荧光现象：（含图）用肉眼可以观察到叶绿素提取液在光的照射下，具有荧光，反射光为绿色，透射光为深红色，表明叶绿素提取含量较高。

光氧化：（含图）将色素提取液放在太阳光下30分钟，色素提取液由深绿色变为深黄色。

参考文献 PPT，植物生理学课本第8版

光合色素的吸收光谱对我们理解光合作用有何意义？答：叶绿体色素的吸收光谱的峰值分别在430nm左右和660nm左右。基本不吸收绿光，因为绿光被反射所以叶子显绿色。也就是说主要吸收这些波长的光的能量在叶绿体内合成植物所需要的物质。

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